2022-11-17
我們的所有細(xì)胞在正常生理狀態(tài)或受到外界刺激下，都可以分泌一類(lèi)具有膜結(jié)構(gòu)的囊泡，被稱(chēng)為細(xì)胞外囊泡。
細(xì)胞外囊泡是由多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞主動(dòng)釋放的納米級(jí)胞外小泡，根據(jù)其生物起源、大小、生物物理特性可分為外泌體、微囊泡及凋亡小體。在我們的臨床研究中主要關(guān)注的是外泌體。
圖1：外泌體結(jié)構(gòu)示意圖
與其它幾類(lèi)細(xì)胞外囊泡相比，外泌體的結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，可以包裹的內(nèi)容物也更加豐富，使外泌體成為優(yōu)異的藥物遞送載體，且豐富的內(nèi)含物使之具有診斷潛力。外泌體可以在相鄰和遠(yuǎn)端細(xì)胞之間傳遞蛋白質(zhì)和遺傳信息，遞送多種類(lèi)型的分子（包括核酸）。此外，外泌體具有穿過(guò)細(xì)胞膜、不易引起免疫反應(yīng)特點(diǎn)，這也使其在基因、抗腫瘤等藥物的體內(nèi)運(yùn)送方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。
外泌體在人體的腦脊液，唾液，血液，乳液等體液中均有分布，此外，腫瘤組織，神經(jīng)元，干細(xì)胞等在體外培養(yǎng)的細(xì)胞均會(huì)分泌大量的外泌體。外泌體本身具有高度異質(zhì)性，且其異質(zhì)性根據(jù)其大小、含量(載物)、對(duì)受體細(xì)胞的功能影響以及細(xì)胞來(lái)源會(huì)出現(xiàn)差異，具備不同的功能，研究證實(shí)，外泌體具備調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄翻譯、細(xì)胞增殖與凋亡、轉(zhuǎn)移與侵襲、血管生成、免疫應(yīng)答、細(xì)胞分化、代謝調(diào)控等功能。此外，隨著外泌體在臨床方面優(yōu)勢(shì)的顯現(xiàn)，其發(fā)展正處于高速發(fā)展的階段，無(wú)論是國(guó)內(nèi)還是國(guó)外，對(duì)于外泌體的研究都在逐步增多。
外泌體的發(fā)展歷程
1983年，Eberhard G.Trams于綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)一種有膜結(jié)構(gòu)的小囊泡（外泌體）；
1987年，Johnstone將其命名為"Exosome"（外泌體）；
1996年，GRaposo發(fā)現(xiàn)類(lèi)似于B淋巴細(xì)胞能分泌抗原提呈外泌體，這種外泌體攜帶MHC-I類(lèi)分子、共刺激因子和粘附因子。研究表明這種B細(xì)胞來(lái)源的外泌體可以直接刺激效應(yīng)CD4+細(xì)胞的抗腫瘤反應(yīng)。
1998年，LZitvogel等發(fā)現(xiàn)樹(shù)突細(xì)胞(DO cell)也能產(chǎn)生有抗原提呈能力的外泌體，而且外泌體含有功能性的MHC-I類(lèi)和I類(lèi)分子，還有共刺激因子。這種外泌體啟動(dòng)了特異性的CTL殺傷作用，促進(jìn)了T細(xì)胞依賴(lài)的抗腫瘤效應(yīng)。
2007年，HValadi等發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞之間可以通過(guò)外泌體中的RNA來(lái)交換遺傳物質(zhì)。這意味著細(xì)胞可以通過(guò)外泌體影響另外一個(gè)細(xì)胞，甚至可以把自己的基因強(qiáng)加給另外一個(gè)細(xì)胞。研究人員逐漸對(duì)小小的外泌體產(chǎn)生了極大的好奇。他們發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞的外泌體與正常細(xì)胞的外泌體之間存在差異，腫瘤的外泌體會(huì)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，腫瘤周?chē)M織細(xì)胞分泌的外泌體具備殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。
2013年，諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)?lì)C給了美國(guó)科學(xué)家JamesERothman和RandyV V.Schekman，德國(guó)科學(xué)家ThomasCSüdhof，以表彰他們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)部囊泡(外泌體等)運(yùn)輸調(diào)控機(jī)制。使外泌體的研究達(dá)到全新的高度。
2015年，JHuan等人證實(shí)了急性髓細(xì)胞白血病的外泌體在白血病的骨髓微環(huán)境中具有抑制造血干細(xì)胞的功能。
2015年，WANGY等人發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的外泌體可以在心肌細(xì)胞受到急性心肌缺血影響時(shí)，給心肌細(xì)胞傳送保護(hù)信號(hào)。
2015年6月24日，德克薩斯大學(xué)MD安德森癌癥中心的一項(xiàng)研究在《Nature》雜志上發(fā)布，研究發(fā)現(xiàn)存在于癌癥外泌體(exosomesF的olvpican-1(GPC1)基因編碼蛋白，或許可以作為一種潛在非侵入性診斷和篩查工具的組成部分，用來(lái)檢測(cè)有可能尚處于適合手術(shù)治療階段的早期胰腺癌。研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌小鼠模型還未顯示出MRI可以檢測(cè)到的胰腺疾病跡象之時(shí)，GPC1+crExos就檢測(cè)到了胰腺癌的可能性。相比常用的CA19-9生物標(biāo)志物，GPC1+crExos似乎是一種更可靠的篩查工具。
2016年1月21日，世界首款由Exosome Diagnostics公司研發(fā)生產(chǎn)的癌癥診斷產(chǎn)品 ExoDxLung通過(guò)FDA認(rèn)證。該檢測(cè)試劑盒是通過(guò)分析血液中的外泌體RNA(exoRNA)可以靈敏、準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者的EML4-ALK突變。ExoDxLung檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌的靈敏度可達(dá)88%，Exosome Diagnostics表示其特異性高達(dá)100%，可以用于幫助醫(yī)生確定哪些非小細(xì)胞肺癌患者可用ALK抑制劑靶向治療，尤其是對(duì)那些不能或者不愿進(jìn)行組織活檢的病人。
就外泌體的研究方向而言，干細(xì)胞、免疫、 microRNA、靶向給藥、癌癥的診斷及治療等都是熱門(mén)研究領(lǐng)域。目前，已有越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始關(guān)注外泌體在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用及其機(jī)制。
外泌體發(fā)展現(xiàn)狀
1、外泌體研發(fā)情況
目前學(xué)術(shù)界、工業(yè)界對(duì)于外泌體的研究研發(fā)方向主要聚焦在疾病早期診斷的標(biāo)志物、疾病治療藥物、外泌體的抑制、以及藥物遞送載體四大方面。目前研究較多的主要集中在來(lái)源于多能干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的外泌體上。
①外泌體在間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）領(lǐng)域研究進(jìn)展
世界抗衰老臨床醫(yī)學(xué)的先驅(qū)、美國(guó)抗衰老醫(yī)學(xué)研究會(huì)主席Ronald Klatz博士稱(chēng)：“外泌體是干細(xì)胞技術(shù)的下一個(gè)發(fā)展方向”。而干細(xì)胞外泌體的進(jìn)步也是得益于干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展。另外，MSCs來(lái)源的外泌體具有與母細(xì)胞相似的生物學(xué)功能，但與MSCs相比具有以下優(yōu)勢(shì)：(1)外泌體穩(wěn)定，可長(zhǎng)期保存在-80℃環(huán)境中，內(nèi)容物不易降解；(2)外泌體更安全，不存在異倍體的可能性；(3)外泌體可以跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，直接靶向作用于病變部位；(4)“無(wú)細(xì)胞”治療，降低了免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn)，致瘤性降低，解決了MSCs在體內(nèi)存活率低的問(wèn)題。
例如，心血管疾病是導(dǎo)致人類(lèi)死亡的主要原因之一，而間充質(zhì)干細(xì)胞釋放的外泌體（MSCs旁分泌的集合體，EVs）作用于心臟和血管，可以發(fā)揮抗凋亡、抗炎和抗纖維化、抑制氧化應(yīng)激、增強(qiáng)血管生成等作用，是MSCs移植治療關(guān)鍵的作用機(jī)制。外泌體在癌癥、心血管疾病、結(jié)核病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等疾病的診斷、治療均已顯示出良好的效果。
所列局限性尚未有足夠研究正式明確，但考慮到間充質(zhì)干細(xì)胞在研究中所潛在的問(wèn)題，由其衍生的外泌體應(yīng)用是否也會(huì)在將來(lái)的研究中顯示潛在局限性，尚需研究證明。
②外泌體在腫瘤領(lǐng)域中研究進(jìn)展
有研究發(fā)現(xiàn)，MSCs發(fā)揮作用主要是由于其旁分泌機(jī)制，而外泌體作為旁分泌機(jī)制的重要因子在腫瘤發(fā)生發(fā)展及治療方面受到越來(lái)越多的關(guān)注。外泌體在腫瘤免疫中起著雙刃劍的作用，在腫瘤微環(huán)境中，外泌體能夠在腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞和其他細(xì)胞之間傳遞生物活性分子，幫助癌細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視誘導(dǎo)免疫耐受，同時(shí)，來(lái)自免疫細(xì)胞的外泌體能夠發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)、增殖和轉(zhuǎn)移的作用。
目前，外泌體在癌癥中主要用于腫瘤疫苗和藥物載體。外泌體生物相容性好，更低的免疫原性；幾乎無(wú)毒性；納米尺寸和柔韌性使它們能夠跨越主要的生物屏障，例如血腦屏障、胎盤(pán)屏障等，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜系統(tǒng)部位的遞藥，是安全而穩(wěn)定的內(nèi)源性納米載體。
圖2：MSCs-Exo 潛在局限性
臨床上用于體內(nèi)遞送的mRNA載體主要是脂質(zhì)納米顆粒，但由于其封裝過(guò)程耗時(shí)、復(fù)雜，不適合個(gè)性化腫瘤疫苗的定制生產(chǎn)。因此，迫切需要一種能夠快速展示mRNA抗原并具有先天免疫刺激功能的新型納米載體，以進(jìn)一步開(kāi)發(fā)基于mRNA的個(gè)性化腫瘤疫苗。國(guó)家納米科學(xué)中心聶廣軍團(tuán)隊(duì)使用細(xì)菌來(lái)源的外泌體（OMVs）作為mRNA遞送平臺(tái)，并通過(guò)基因工程對(duì)其進(jìn)行表面修飾（OMV-LL），試驗(yàn)結(jié)果表明OMV-LL-mRNA不但能夠顯著抑制腫瘤進(jìn)展，而且可以誘導(dǎo)長(zhǎng)期免疫記憶。這種外泌體載體不同于LNP，可用于個(gè)性化mRNA腫瘤疫苗開(kāi)發(fā)，有望在mRNA疫苗中得到廣泛應(yīng)用。
③外泌體作為生物標(biāo)志物
隨著外泌體研究的深入，許多研究表明，外泌體可作為疾病早期診斷的生物標(biāo)志物。首先，外泌體廣泛分布于體液中，如血液、尿液、精液、羊水和唾液，因此很容易分離。其次，如上所述，不同衍生的外泌體在組成上有所不同，表達(dá)特定的miRNA、mRNA 和蛋白質(zhì)。這些成分的異常變化可以用來(lái)診斷疾病和預(yù)測(cè)患者的預(yù)后。例如，可以在前列腺癌患者的尿外泌體中檢測(cè)到 PCA3 mRNA 和 TMPRSS2:ERG 融合轉(zhuǎn)錄物。此外，大量 miRNA 被認(rèn)為是新的生物標(biāo)志物。
圖3：作為生物標(biāo)志物的潛在外泌體 miRNA
然而，作為生物標(biāo)志物的外泌體存在一些缺陷。首先，來(lái)自癌癥患者和健康人的外泌體在成分上可能沒(méi)有可檢測(cè)到的差異。在上述研究中，TMPRSS2:ERG 融合轉(zhuǎn)錄本可以在惡性程度較高的患者中檢測(cè)到，但在惡性程度較低的患者中則無(wú)法檢測(cè)到。26其次，外泌體中的 miRNA 的特異性不足以區(qū)分不同類(lèi)型的癌癥。例如，miR-21 在幾乎所有癌癥中上調(diào)，例如黑色素瘤、肝細(xì)胞癌、乳腺癌、腦癌、胃癌和結(jié)腸癌；32 miR-125b 在急性髓性白血病 (AML) 中上調(diào)，但在慢性淋巴細(xì)胞白血病 (CLL) 中下調(diào)。33 第三，考慮到臨床實(shí)踐的準(zhǔn)確性、成本和效率，大多數(shù)外泌體生物標(biāo)志物在臨床上并不可行。
2、外泌體市場(chǎng)狀況
近幾年，基礎(chǔ)科研領(lǐng)域有關(guān)外泌體的載藥、診斷、預(yù)后監(jiān)測(cè)、免疫療法等方向的論文發(fā)表數(shù)量呈近爆炸式增長(zhǎng)，平均每年外泌體相關(guān)論文都在3000篇以上，2020年度國(guó)家自然科學(xué)基金申請(qǐng)項(xiàng)目的評(píng)審結(jié)果中，外泌體相關(guān)課題中標(biāo)達(dá)到兩千余項(xiàng)。
圖4：外泌體領(lǐng)域發(fā)表論文數(shù)量的增長(zhǎng)
同時(shí)在產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化領(lǐng)域，近年來(lái)外泌體領(lǐng)域的初創(chuàng)企業(yè)數(shù)量和規(guī)模不斷增長(zhǎng)，全球有近50家企業(yè)“同臺(tái)競(jìng)技”。
由于外泌體的標(biāo)志物并不明確等原因，外泌體診斷領(lǐng)域發(fā)展相對(duì)緩慢。大多企業(yè)選擇布局進(jìn)展更快的外泌體載藥或者外泌體藥物開(kāi)發(fā)領(lǐng)域，成功的幾率會(huì)更大些。
全球外泌體相關(guān)企業(yè)近1/3布局外泌體診斷業(yè)務(wù)；超過(guò)2/3布局外泌體治療。集中布局在腫瘤、腦部疾病、疫苗開(kāi)發(fā)、基因治療/罕見(jiàn)病四大領(lǐng)域。
圖5：全球外泌體相關(guān)企業(yè)在各細(xì)分領(lǐng)域布局業(yè)務(wù)情況
自全球爆發(fā)的COVID-19使對(duì)外泌體的研究出現(xiàn)高潮，外泌體可以有效地用于冠狀病毒疫苗的開(kāi)發(fā)。根據(jù)全球市場(chǎng)研究公司Data Bridge Market Research的數(shù)據(jù)，2018年全球外泌體市場(chǎng)達(dá)到65億美元。該市場(chǎng)預(yù)計(jì)將以21.9%的復(fù)合增長(zhǎng)率增長(zhǎng)，到2026年將增長(zhǎng)到310億美元，市場(chǎng)空間極具發(fā)展?jié)摿Α?/p>
外泌體領(lǐng)域的產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化研究，國(guó)外已經(jīng)發(fā)展很多年，目前已有一些突破性的成果和技術(shù)相對(duì)成熟的公司。但國(guó)內(nèi)利用外泌體的治療市場(chǎng)處于起步階段，國(guó)內(nèi)外在外泌體的產(chǎn)業(yè)化研究方面至少相差5年時(shí)間。著力于解決制約外泌體產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵問(wèn)題，如外泌體的靶向性遞送，分離純化，載藥效率、制劑等問(wèn)題，完成這些基礎(chǔ)性問(wèn)題的突破才可能實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)上的突破，在全球外泌體市場(chǎng)中占得更多份額。
外泌體未來(lái)發(fā)展
外泌體運(yùn)用于藥物載體的主要挑戰(zhàn)在于如何獲得高產(chǎn)量的純外泌體、如何增強(qiáng)外泌體裝載各種貨物的能力和靶向能力但不破壞外泌體結(jié)構(gòu)。診斷治療中外泌體要求更精細(xì)，主要難點(diǎn)在于：⑴外泌體標(biāo)志物不明確、未經(jīng)臨床驗(yàn)證；⑵外泌體分離純度要求較高，需要保證相關(guān)生物標(biāo)志物直接來(lái)源于外泌體而非其它分泌物或者細(xì)胞器；⑶檢測(cè)同種疾病，外泌體診斷產(chǎn)品是否更加靈敏和準(zhǔn)確，成本上是否更具優(yōu)勢(shì)，也是決定外泌體診斷產(chǎn)品是否被患者所選擇的重要條件。種種困難的存在，造成目前外泌體診斷領(lǐng)域發(fā)展地相對(duì)緩慢。
圖6：外泌體分離方法優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比
為了獲得高產(chǎn)量的純外泌體，有以下幾種策略：①拓展外泌體來(lái)源。②努力將細(xì)胞和納米載體的特性結(jié)合起來(lái)。③增強(qiáng)裝載各種貨物的能力和靶向能力。因此，許多研究人員致力于開(kāi)發(fā)合適的方法來(lái)修飾外泌體以裝載藥物或基因。
而從企業(yè)的發(fā)展策略上來(lái)講，由于外泌體診斷產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的更多限制和困難，大部分企業(yè)選擇布局進(jìn)展更快的外泌體載藥或者外泌體藥物開(kāi)發(fā)領(lǐng)域，成功的幾率更大。
相對(duì)較少的企業(yè)布局外泌體診斷領(lǐng)域，并不是放棄外泌體在診斷領(lǐng)域的應(yīng)用開(kāi)發(fā)。可能是出于風(fēng)險(xiǎn)效益的角度考慮，企業(yè)更愿意將外泌體診斷相關(guān)的布局放在企業(yè)戰(zhàn)略布局的第二梯隊(duì)。在搭建外泌體載藥平臺(tái)或開(kāi)發(fā)外泌體相關(guān)藥物的同時(shí)，對(duì)外泌體進(jìn)行更加深入的認(rèn)識(shí)和解，新藥研發(fā)者們同樣擁有機(jī)會(huì)去對(duì)外泌體的相關(guān)生物標(biāo)志物進(jìn)行挖掘和發(fā)現(xiàn)。在此過(guò)程中，一旦發(fā)現(xiàn)任何有價(jià)值的生物標(biāo)志物，再快速跟進(jìn)布局它在檢測(cè)診斷相關(guān)疾病方面的應(yīng)用，更具有指導(dǎo)意義和發(fā)展價(jià)值。
某種意義上而言，外泌體的藥物載體開(kāi)發(fā)和診斷領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)是一個(gè)相輔相成的過(guò)程。針對(duì)外泌體的來(lái)源、合成與分泌、攝取等機(jī)制研究，針對(duì)微環(huán)境從外泌體角度解釋疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究，尋找疾病診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物，將外泌體作為藥物載體類(lèi)的研究。不管是研究哪一個(gè)方向，都有很多科學(xué)問(wèn)題待解決，系統(tǒng)深入的研究對(duì)外泌體整個(gè)行業(yè)的發(fā)展都具有推進(jìn)作用，各方向布局也會(huì)由此展開(kāi)，所以我們有理由相信外泌體只是“年輕”，它的未來(lái)值得大家期待。
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